Věčný odkaz Louise Pasteura: Kde rostou kvasinky a jak probíhá alkoholové kvašení

Pasteurova spanilá jízda

Ačkoliv Louis Pasteur (1822–1895) započal svoji kariéru jako vynikající chemik, stal se jedním z nejuznávanějších mikrobiologů všech dob. Spíše než vědce, který zásadním způsobem změnil naše chápání alkoholového, ale také mléčného a octového kvašení, si jej mnozí z vás vybaví jako objevitele vakcíny proti vzteklině a sněti slezinné (antrax). Velký význam pro budoucí medicínu měla jeho teorie, že nemoci, hniloba a zánět jsou způsobeny živými mikroorganismy, čímž vyvrátil teorii o samoplození, tj. vznik živých bytostí bez rodičů z neživé látky.

Je obvykle popisován jako mistr experimentální vědy zcela posedlý svým výzkumem, bez smyslu pro humor, politicky konzervativní, katolík a roajalista. Původně se zajímal o krystalografii a za své výsledky získal prestižní ocenění Královské akademie v Londýně. Co jej ale přimělo dát se na cestu mikrobiologie a odhalit pro lidstvo dosud neznámá zákoutí alkoholového kvašení? Jeho výzkum optické aktivity organických sloučenin, jako jsou tartráty, asparagin a kyselina jablečná, ho přivedly k přesvědčení, že všechny organické sloučeniny s optickou aktivitou byly vytvořeny živými organismy. A odtud byl už jen krůček ke studování těchto látek, které byly mikroorganismy produkovány.

V pozdních 50. létech 19. století započal Pasteur svůj výzkum na zkvašování cukru. Byla to doba, kdy většina vědců a praktiků v kvasném průmyslu přijala teorii německého fyziologa Theodora Schwanna, kterou vyslovil před 20 lety, a to že kvasinka je živý organismus. Bylo to také období, kdy biologové převzali studium kvasinek do svých rukou, ačkoliv podstata fermentace i biologická povaha kvasinek byly stále věcmi zmatečnými a kontroverzními. Chemici i nadále interpretovali změny způsobené mikroorganismy ve smyslu chemických reakcí a položili tak základy enzymologie.

Během Napoleonských válek znemožnila britská námořní blokáda dovoz třtinového cukru ze Západní Indie (antilské ostrovy a bahamské souostroví v Karibiku) a jihovýchodní Asie, a tak francouzští producenti alkoholu museli začít ve velkém pěstovat cukrovou řepu, zejména v severní Francii. Když byl Pasteur v roce 1854 jmenován profesorem chemie na univerzitě v Lille, byl pověřen přímo vládou Napoleona III. Ministr pro veřejné mínění tehdy napsal rektorovi univerzity:

„… s cílem dosáhnout užitečných a dalekosáhlých výsledků, a současně držet krok s vědeckou teorií, pan Pasteur … musí nicméně přizpůsobit četné aplikace skutečným potřebám země.“

V roce 1856 oslovil Pasteura místní výrobce alkoholu z cukrové řepy pan Bigo, neboť ho trápily série neúspěšných pokusů s kvašením. Bigův syn, který u Pasteura studoval, otci napsal:

„Pasteur viděl pod mikroskopem, že kuličky (= kvasinky) byly kulaté, když byla fermentace na vrcholu, prodlužovaly se, když započalo její upadání, a všechny byly úplně prodloužené (= bakterie mléčného kvašení), když alkoholové kvašení přešlo v mléčné kvašení. Tato velmi jednoduchá metoda nám umožnila sledovat proces a zabránit selhání kvašení, které se dříve často stávalo.“

V následujících letech Pasteur publikoval řadu studií o alkoholovém kvašení. Například zjistil, že v růstovém médiu obsahujícím vínan amonný zmizel amoniak, když kvasinky současně rostly a zkvašovaly glukózu. Tím upozornil na skutečnost, že dusíkaté látky hrají ve výživě a růstu kvasinek důležitou roli. Z dnešního pohledu je to samozřejmost a asimilovatelný dusík patří mezi významné měřitelné parametry vína a moštu.

Kromě toho vyprodukoval i první kvasinkovou kulturu v chemicky definovaném médiu skládajícím se z cukru, vínanu amonného a anorganického fosfátu. V roce 1959, tedy ve stejném roce, kdy Charles Darwin vydává své životní dílo O původu druhů, Pasteur objasnil mléčné kvašení a stanovil čtyři obecné poznatky, které můžeme srovnat s pozdějšími slavnými postuláty Roberta Kocha, zakladatele bakteriologie.

Slavná baňka col de cygne

Pro své experimenty používal Pasteur baňku s labutím krkem col de cygne. Benátští skláři byli první, kdo experimentoval s lahvemi s dlouhým, zakřiveným a protaženým hrdlem, který připomínal labutí krk. Od 16. století se takové lahve importovaly zejména do Persie, kde se staly součástí šíitských pohřebních rituálů a byly známé jako ashdan či nádobka na slzy. Ovšem Pasteur v nich viděl docela jiný potenciál a nechal si takové lahve přizpůsobit pro své pokusy.

Myšlenka, že by život mohl vzniknout spontánně z neživých látek, tzv. teorie samoplození či abiogeneze, byla známá již od starověku a dokonce v době Pasteura ji někteří vědci stále oprašovali a vysvětlovali tak, proč se převařené výživné bujóny v přítomnosti vzduchu najednou zakalily a obsahují mikroorganismy. Přestože svým prvním pokusem s převařenou tekutinou, která obsahovala na začátku živé kvasinky a byla uchovávána bez přístupu vzduchu a jakékoliv kontaminace, Pasteur vyvrátil myšlenku samoplození, stále čelil mnoha kritickým hlasům.

A tak vymyslel způsob, jak nechat vniknout do nádoby s převařeným bujónem vzduch a zároveň zabránit vstupu drobných organismů, které viděl pod mikroskopem (viz obrázek níže). Tímto pokusem i těm nejzarytějším kritikům doslova vytřel zrak. S pomocí baňky col de cygne připravil rozhodující důkaz o tom, že se žádné živé mikroorganismy v živném roztoku neobjevily ani po měsících pozorování. A pokud se přece jen se vzdušným prachem do baňky nějaké mikroorganismy dostaly, uvízly v úzkém zahnutém hrdle. Pokud však takový „prach“ přišel do přímého kontaktu s živným roztokem, mikrobi se objevili do 2–3 dnů. Za experimentální vyvrácení teorie samoplození získal Louis Pasteur v roce 1862 Alhumbertovu cenu.

Tento experiment byl prvním krokem k objasnění záhady, odkud se berou kvasinky, které se účastní alkoholového kvašení moštu.

Kde bydlí kvasinky?

V roce 1861 Pasteur zveřejnil svoji nejslavnější práci o kvasinkách, v níž popsal rozdílné účinky přítomnosti a naopak nepřítomnosti kyslíku na zkvašování cukru. Pro tyto dvě podmínky v roce 1863 zavedl termíny aerobní a anaerobní. Zjistil, že v baňkách bez kyslíku kvasinky rostly jen trochu, ale zkvašovaly cukr, zatímco v baňkách s kyslíkem se sice tvořilo mnohem více kvasinek, avšak jejich kapacita zkvašovat cukr se téměř vytratila. Tímto experimentem zjistil, že produkce kvasinek na 1 g cukru je 20× vyšší za přítomnosti kyslíku než v jeho nepřítomnosti.

V roce 1866 Pasteur vydal knížku Studie o víně (Études sur le Vin), ve které se zabýval chorobami vína a tomu, jak jim předcházet. Zejména se zajímal o vína z oblasti Arbois v Juře, kde jeho otec pracoval jako koželuh a sám Pasteur chodíval do školy. Zde studoval slavné vin jaune z Château-Châlons – dlouhověké, silně alkoholické víno, které v překladu znamená žluté víno podle barvy, kterou získalo oxidací v sudu a které připomíná suché fino sherry.

Podobně jako sherry mají i vine jaunes ponechaný několikaletý tzv. ullage neboli vzdušný prostor mezi vínem a horní částí nádoby, v níž je víno uskladněno (při každém stáčení není sud zcela naplněn). Víno tak zraje za přítomnosti vzduchu a na jeho povrchu se vyvíjí silná bílá blanka z kvasinek nazývaná voile (závoj) či fleur du vin neboli vinný květ, pod níž je víno čiré. Tato blanka je srovnatelná s tvorbou floru při výrobě sherry.

O 10 let později vychází spis Studie o pivu (Études sur la Bière), v němž se Pasteur věnuje alkoholickému kvašení piva, jeho nemocem a srovnal výrobu piva a vína. Ovšem otázka, kde se vinné kvasinky berou, nedávala Pasteurovi spát. Pozoroval, že kvasinky se nachází v různých rostlinných šťávách, které jsou silně kyselé. A naopak, pokud jejich kyselost poklesla, začaly se v nich objevovat i bakterie.

A tak navrhl experiment se svými oblíbenými baňkami s labutím krkem, kterým dokázal, že mikroorganismy, které kvasí hroznový mošt, se vyskytují na povrchu bobulí révy. Čtyřicet baněk o objemu 250–300 ml naplnil filtrovaným a svařeným moštem, který dosud nebyl zkvašen. Vinné hrozny opláchl ve vodě. Když tuto vodu prohlédl pod mikroskopem, zjistil, že obsahuje mikroorganismy, které předtím žily na povrchu slupky bobulí.

Deset lahví ponechal bez jakýchkoliv přísad jako kontrolní. Do druhé sady deseti baněk kápl několik kapek vody, která zůstala po opláchnutí bobulí. Do třetí sady deseti lahví přidal tuto tekutinu avšak převařenou. A konečně do poslední sady baněk přikápl čerstvý nefermentovaný mošt, který získal odsátím z nepoškozených bobulí (viz obrázek nahoře). To udělal tak, že jeden konec baňky byl protažen do ostré a úzké špičky zatavené plamenem. Tu pak zapíchl do omyté bobule; špička se uvnitř odlomila a pod tlakem bylo do baňky „sterilně“ nasáto několik kapek čerstvé šťávy. Po vytažení byla špička opět zatavena. Poté, co proběhla inkubace, kvašení proběhlo pouze v baňkách, do nichž byla přidána nepřevařená voda, která zbyla po opláchnutí hroznů a která obsahovala živé mikroorganismy.

Co uviděl Pasteur pod mikroskopem?

Pasteur si byl plně vědom existence nejen odlišných druhů baktérií, ale také různých druhů kvasinek. Ty začaly být záhy popisovány z mnoha zdrojů, jako je například pivo, víno, sýr, tlející dřevo, stromy a lanýže, ale i lidská moč, střeva, ústa, kůže a srst. Sám se však o taxonomii, tedy o popisování a třídění organismů na základě morfologických znaků, nikdy zvlášť nezajímal.

Kromě toho také pozoroval, že se určité druhy kvasinek zapojovaly do časných fází alkoholového kvašení a jiné byly přítomny, když byl téměř veškerý cukr zkvašen. Aby mohl pozorovat mikroorganismy přímo v kvasícím vínu, sestrojil si jedinečný nástroj. U slavného skláře Heinricha Geisslera z Bonnu si nechal vyrobit skleněnou trubku vyfouknutou do zploštělé koule, kterou umístil na stolek mikroskopu. Přes ni pak pouštěl kvasící mošt a pozoroval čilý život v něm.

Jako jeden z prvních vědců tak Pasteur pozoroval posloupnost, s jakou se různé druhy kvasinek účastní alkoholového kvašení. Pasteurova ilustrace (obrázek níže), kterou pořídil při pozorování tímto nástrojem, ukazuje dva druhy kvasinek. První kvasinka, která se objevovala na začátku fermentace, byla citronovitého tvaru a označena jako Saccharomyces apiculatus (dnes nazývaná Hanseniaspora uvarum). Tyto tzv. apikulátní kvasinky jsou nejčastější zástupci divokých kvasinek žijících na povrchu bobulí ve vinohradu.

Druhý typ kvasinek, který pokračoval ve fermentaci, když se zvýšila hladina etanolu, byly již větší buňky s krátce oválnými až kulovitými buňkami, které Pasteur nazýval Saccharomyces pastorianus nebo Saccharomyces ellipsoideus (dnes zvaná Saccharomyces cerevisiae neboli pravá vinná kvasinka). Tato jména zavedl Max Reess ve své knize o houbách schopných alkoholového kvašení vydané v roce 1870.

Konec jedné éry

Pasteurův výzkum založený na pečlivých a důmyslných experimentech přispěl zásadním způsobem k biologickému poznání kvasinek a kvašení obecně. V letech 1855–1875 Pasteur jednoznačně stanovil: roli kvasinek při alkoholovém kvašení, že kvašení je fyziologický jev, a jaké jsou rozdíly mezi aerobním a anaerobním využitím cukru kvasinkami.

Nějakou dobu se také potýkal s rovnicí alkoholového kvašení, tak jako Lavoisier před 70 lety. Snažil se do ní totiž vtěsnat vedlejší produkty kvašení jako glycerol a kyselinu jantarovou. A to se mu nedařilo. Rovněž se mu nepodařilo z kvasinek izolovat enzym, který se na kvašení podílel.

To se podařilo až německému chemikovi Eduardovi Buchnerovi, který za svoji práci získal v roce 1907 Nobelovu cenu za chemii. Buchner předpokládal, že kvasinky do svého prostředí vylučují bílkoviny za účelem zkvašování cukrů. Až mnohem později bylo zjištěno, že kvašení probíhá uvnitř kvasinkových buněk za působení těchto bílkovin neboli enzymů.

Dobře navrženými pokusy Pasteur vyvrátil tvrzení von Liebiga, a to že kvasinky jsou neživé a vznikají působením kyslíku na dusíkatou složku zkvašované tekutiny (viz předchozí článek o alkoholovém kvašení).

V roce 1870 baron Justus von Liebig výrazně změnil svůj postoj vůči alkoholového kvašení a částečně otočil. Přijal všeobecně uznávanou teorii, že kvasinka je živý organismus, ale stále odmítal koncept kvašení jako fyziologického procesu. Nedokázal si dát do logických souvislostí interpretaci experimentálních důkazů a nebyl například schopen rozlišovat mezi růstem kvasinek a tím, jak využívají substráty, čili různé tekutiny a média, ve kterých rostou.

Ještě v roce 1880 nebylo alkoholové kvašení, jako znak fyziologické aktivity kvasinek, mezi vědci všeobecně přijímáno. Až do té doby totiž všechna zjištění bránila v pochopení role enzymů v buněčné aktivitě. Teprve později a jen postupně, v devatenáctém a dvacátém století, se role enzymů stala zjevnou a samozřejmou.

Literatura a další zajímavé čtení:

• Barnett J. A. (2000). A history of research on yeasts 2: Louis Pasteur and his contemporaries, 1850–1880. Yeast 16: 755–771.
• Pasteur L. 1859. Mémoire sur la fermentation appelée lactique. Mémoires de la Société Impériale des Sciences, de l'Agriculture et des Arts de Lille (1858) IIe série 5: 13–26.
• Pasteur L. 1860. Mémoire sur la fermentation alcoolique. Annales de Chimie et de Physique 58: 323–426.
• Pasteur L. 1860. Note sur la fermentation alcoolique. Comptes Rendus Hebdomadaires des Séances de l'Académie des Sciences, Paris 50: 1083–1084.
• Pasteur L. (1861). Infuence de l'oxygène sur le dèveloppement de la levûre et la fermentation alcoolique. Bulletin de la Société de Paris (Résumé de Séance du 28 juin): 79–80.
• Pasteur L. (1873). Études sur le Vin, 2nd. edn. Savy, Paris.
• Pasteur L. (1876). Études sur la Bière. Gauthier-Villars, Paris.

Související články:
Hádanka alkoholového kvašení a pře o to, zda je kvasinka živá, či neživá (období 1789–1850)